载脂蛋白E基因型对离线记忆巩固的影响

Abstract
最近的一些静息状态功能磁共振成像(RS-fMRI)研究表明，RS-fMRI可以映射离线记忆巩固效应。最近的一些静息状态功能磁共振成像(RS-fMRI)研究表明，RS-fMRI一些技术可以映射离线记忆巩固效应。 然而，基因对于记忆巩固过程在很大程度上仍然是未知的。本研究收集了两组健康人（两组健康人分别携带不同基因，即：APOE e2/e3和APOE e3/e4。）记忆编码前和记忆编码后的RS-fMRI sessions。本研究选取ReHo ratio作为研究指标，APOE e3/e4组颞叶内侧的ReHo比值较大，颞叶内测的ReHo ratio与APOE e3/e4组的识别记忆性能显著相关，而e2/e3组则与其识别记忆性能不相关。此外，APOE e3/e4组枕叶和顶叶图像编码区的ReHo ratio较低。结果表明，APOE e3/e4组可能有与e2/e3组不同的离线记忆巩固过程。这些结果可能有助于产生未来的假设，即离线记忆巩固可能会在阿尔茨海默病中受损。
Introduction
Muller和Pilzecker认为新的记忆在编码之后需要时间来巩固。许多研究表明，记忆编码后自发的大脑活动与记忆巩固有关。 Single-unit recording的动物研究认为学习后的海马位置细胞的自发活动与记忆巩固有关。RS-fMRI提供了独特的无创技术来研究人脑的自发活动。最近的RS-fMRI研究表明，自发性脑活动与最近情景的记忆巩固有关。基于记忆巩固的系统水平理论的动物相关研究认为初始记忆存储和召回主要与颞叶内侧（主要是海马和海马旁）相关而新皮层被认为是存储永久记忆的区域。最新的记忆巩固研究也认为颞叶内测在记忆巩固过程中扮演者多个角色。但是，基于RS-fMRI技术的脑区间的功能链接没有揭露是否特殊脑区的局部脑活动被前面的任务影响。只有两项研究测量了人的局部活动与记忆巩固之间的关系。一项研究使用灌注MRI发现，在学习任务后海马和颞叶区域的脑血流增加，并且增加与灌注相关。我们小组最新另一项研究发现，在一组情景记忆任务中，一组参与者在随后的意外检索任务中表现更好，但在情景记忆任务后，颞叶内测的自发性fMRI信号的局部同步性增加了，但在一组表现较差的小组中却没有增加。APOE e4等位基因的存在与散发性阿尔茨海默病(AD)的风险增加有关。微小的情景记忆缺陷是AD最早的认知症状。结构MRI研究发现AD患者颞叶内测明显萎缩。功能性MRI研究一致显示AD和健忘轻度认知障碍(MCI)患者的颞叶内测激活异常。也有报告携带APOE e4基因的正常人在海马记忆编码阶段发现激活异常。所有这些研究都为AD或APOE e4携带者的颞叶内侧与情景记忆缺失有关提供了有力的证据。因此，我们的第一个假设是，与e4非载体相比，APOE e4携带者健康人在MTL中可能有不同的记忆巩固过程。
之前的两项RS-fMRI研究发现，与刺激编码相关的脑区之间的功能连接改变与记忆巩固相关。Albert等人表明被认为参与视觉运动过程的静息态额顶网络 是通过运动学习而不是运动性能来调节的。Tambini等人表明，在一项具有较高的联想记忆性能的任务之后，海马体与枕骨外侧复合区域之间的静息态功能连接的大小发生了变化。基于记忆巩固的系统水平理论的动物相关研究认为初始记忆存储和召回主要与颞叶内侧（主要是海马和海马旁）相关而新皮层被认为是存储永久记忆的区域。因此，我们的第二个假设是在APOE e4健康携带者和非携带者之间，发生图片编码的区域中与离线记忆巩固相关的局部自发活动的变化可能不同。
Materials and Methods
第一项子研究是APOE基因型筛选研究，北京师范大学1220名学生在参加新生入学体检时通过广告被募集。在他们体检期间接受血液取样时在他们知情的情况下额外抽取4ml留用。首先使用盐析法分离DNA，然后使用PCR-RFLP技术对1220个样本中的917个进行了APOE等位基因分型。APOE一共可分为如下六个基因型：e2/e2 (N = 1), e2/e3(N = 52), e2/e4 (N = 13), e3/e3 (N = 799), e3/e4 (N = 51),e4/e4 (N = 1)。 大约一年后，从上述样本中选出40名健康的汉族学生（18-23岁）、有19名携带e2/e3基因的被试和20名与之性别相匹配得携带e3/e4基因的被试。所有参与者都是右利手并且不伴有AD的遗传史也没有神经或精神疾病的病史。35名（e2/e3基因的20人，e3/e4基因的包含15人）参与者完成了为中国修订的韦氏成人智力量表。一名e2/e3参与者因大脑结构异常而被排除在外。最终，有19名携带e2/e3基因的被试和20名与之性别相匹配得携带e3/e4基因的被试参与以下研究。
 
Scanning Procedure
共进行了五次扫描：
(1)  第一个 RS-fMRI session (REST-1)：参与者被指示保持清醒、闭眼、不想别的事，扫描8分钟（240个volumes）。
(2) 有记忆编码任务的fMRI扫描，参与者被要求对一张照片是室内或室外的用食指在他们的左手或右手上按一个按钮来表明，扫描5分钟（151 volumes）。每张图片出现在屏幕的中心1500毫秒，被试在2000毫秒内做出选择。图片播放间隔时间为500–6500 毫秒 (平均 3500 毫秒)。总共60张图片（30张室内和30张室外），通过Eprime软件以伪随机数算法模拟随机呈现图片。 为了提高准确性和对程序的熟悉程度，在本任务会话之前立即进行了一次简短的练习（10张不同的室内/室外图片），参数与REST-1保持一致。
(3) 结构像扫描大概10分钟获取。
(4) 第二个 RS-fMRI session (REST-2)：扫描8分钟（240个volumes），保持清醒，闭眼，参数与REST-1保持一致。
(5) 记忆提取任务的fMRI扫描：同样的规定进行了两次扫描，每次持续5分钟（每五分钟151个volumes）。 任务之前，参与者被告知将进行测试任务。 相关指令在屏幕上显示并由实验人员阅读。呈现图片时，如果参与者在（2）曾经看过图片，则必须按下右手的按钮。 否则，他们必须按下左手的按钮。 共展示了120张照片，其中60张旧照片（30张室内和30张室外照片）和60张新照片（同旧照片一样的组合）。 记录反应时间（RT）。 扫描参数和图片显示时间与REST-1相同。 在此扫描中，主要使用behavior data （即d-prime，下文中有详解）参与后续分析。
参与者在即将进行memory retrieval task时才被告知有这么一个task的扫描。因此，在（2）与（5）扫描期间，故意记忆性能的可能性被最小化。
 
Pictures for Task Presentation
Memory encoding 和 memory retrieval sessions一共包括120张彩色图片，不分新旧一共是60张室内和60张室外照片。为了使实验过程中保证被试是自然判断而不是靠记忆图片进行的按键行为，我们使用pilot behavioral experiment从180张图片中选择的这120张图片。在这180张图片中，69张是来自IAPS系统，其余的是从互联网上获得的。所有这些图片都可以很容易地分为室内或室外。
我们又招募了12名大学生来进行pilot behavioral experiment。也就是照片收集的详细过程：这个pilot behavioral experiment有一个encoding阶段和一个retrieval阶段，两个阶段中间休息时间约为20分钟。实验指令跟任务都与fMRI相同，同样也是在memory retrieval task之前没有告诉参与者这是一个记忆任务， 在室内或室外的判断任务之后，他们只是被告知休息一下等待另一个行为实验。这些参与者分为3组，每组（4名参与者) 在memory encoding task 阶段使用60幅图像(室内30幅，室外30幅）， retrieval阶段与fMRI任务相同，使用60张旧图片和60张新图片。对于180张旧照片中的每张，都有4位参与者对其进行按键判断，因此，每个图片的命中数将为0、1、2、3和4。 对于命中分数为0或4（即没有参与者或所有参与者都能正确记住）的图片，这些图片中只有一小部分被选为fMRI任务图片。但是对于命中分数为1、2或3的照片，则选择了其中很大一部分。最后，选择了120张图片用于fMRI研究。
Behavior Data Analysis
d-prime是信号检测理论中使用的一种统计量，其计算方法为：d-prime = Z (旧刺激里面被判断为旧刺激，HP) - Z (新刺激里面被判断为旧刺激的个数，FA)。式中Z为标准Z分数（减去均值再除以标准差）。如果是先前见过的图片那么就是旧刺激（旧刺激相当于有信号），如果是先前未见到的图片就是新刺激（新刺激相当于无信号）。 更高的d-prime意味着hit和correct rejection（正确拒斥，新刺激里面被判断为新刺激的个数）之间的更大差异，本文就是指更好的识别记忆性能。人口统计学信息和d-prime结果如下表： 每个被试能得到一个d-prime，年龄、性别、智商和d-prime评分无显著差异。
fMRI Data Preprocessing
所有数据使用DPARSF 做了如下预处理：

1. 去除前10个时间点
2. 时间层矫正
3. 头动矫正（ 由于头动过大，四名受试者(1个TRD、2个TSD和1个HS)的数据被排除外。）
4. 空间标准化
5. 去线性漂移
6. 滤波段选的是 0.01-0.08Hz

 
 
Region of Interest (ROI) Definition
定义MTL（medial temporal lobe）ROI，如下图。 RS-fMRI Data Analysis
本研究选择KCC-ReHo作为研究指标，参数选择27 nearest neighboring voxels。为了量化记忆巩固相关的自发大脑活动的变化，我们引进了ReHo ratio，细节如下：
                  ReHoratio=ReHoREST-2/ReHoREST-1                      （1）
首先，将经过预处理的数据做一个KCC-ReHo计算，然后以体素为单位进行上述公式的计算，提取每个被试的REST-1与REST-2相对位置体素值进行除计算得到该体素的ReHo ratio值，全脑体素都做如此计算，最终每个被试得到一张ReHo ratio map。然后对所有被试的ReHo ratio map做平滑核为4mm的平滑处理。携带两种不同基因型的两组做双样本T检验，加由上述MTL ROI做成的mask。后而做AlphaSim校正，mask仍为MTL mask（这样mask为特定ROI的校正本研究也称其为small volume correction, 即SVC），阈值取p<0.05,cluster size>576 mm³。结果表明在MTL中，APOE e3/e4组的ReHo ratio是高于APOE e2/e3的，如下图：  
 
然后相同基因型定义为一组，将同一组的REST-1与REST-2数据做配对T检验，两组做了两次配对T，mask都选择Figure 2A mask。后而做AlphaSim校正，mask为Figure 2A mask，阈值取p<0.05,cluster size>576 mm³。结果表明在MTL中，APOE e3/e4组的REST-2 的ReHo值高于REST-1，而APOE e2/e3组的REST-1跟REST-2之间无较大差别的。如下图：  
最后，在对各组的ReHo ratio与d-prime进行了相关分析（p<0.05,加Figure 2A mask，SVC），结果表明：在MTL中，APOE e3/e4组的 ReHo ratio与记忆提取阶段的d-prime之间呈正相关,APOE e2/e3组中结果不显著。e3/e4组相关情况如下图： 由于ReHo ratio与记忆提取阶段的d-prime相关性不明显，所以消除掉记忆巩固期间在MTL中由记忆编码引发的激活所带来的潜在的影响，研究使用ANCOVA回归掉该类影响（每个体素的平均β估计）之后，可以得到ReHo ratio与d-prime之间更纯粹的关系。我们发现APOE e3/e4组 ReHo ratio与记忆提取阶段的d-prime之间仍然呈正相关，APOE e2/e3组 ReHo ratio与记忆提取阶段的d-prime之间呈负相关。结果图示如下：  
Region of Interest (ROI) Definition
对encoding task的数据做一个单样本T检验，Base的值选择0，mask选择全脑mask，然后对得到的T图做AlphaSim多重比较校正，mask加全脑mask，阈值取p<0.05,cluster size>270 mm³，得到如下结果：  
Encoding fMRI Data Analysis
首先，将经过预处理的数据做一个KCC-ReHo计算，然后以体素为单位进行上述公式的计算，提取每个被试的Task-1与Task-2相对位置体素值进行除计算得到该体素的ReHo ratio值，全脑体素都做如此计算，最终每个被试得到一张ReHo ratio map。然后对所有被试的ReHo ratio map做平滑核为4mm的平滑处理。携带两种不同基因型的两组做双样本T检验，加由上述encoding-related ROIs做成的encoding-related mask。后而做AlphaSim校正，mask仍为encoding-related mask，阈值取p<0.05,cluster size>2295 mm³。结果表明在枕骨和顶骨区域，APOE e3/e4组的ReHo ratio是低于APOE e2/e3的，如下图和表：   然后相同基因型定义为一组，将同一组的REST-1与REST-2数据做配对T检验，两组做了两次配对T，mask选择Figure 4A mask。后而做AlphaSim校正，mask为Figure 4A mask，阈值取p<0.05,cluster size>1566 mm³。结果表明在枕叶两组的REST-2 的ReHo值高于REST-1，而顶叶只有APOE e2/e3组的REST-2 的ReHo值高于REST-1。如下图：  
最后，在对各组的ReHo ratio与d-prime进行了相关分析（p<0.05,加Figure 4A mask，SVC），结果表明在枕叶APOE e2/e3组中的 ReHo ratio与记忆提取阶段的d-prime之间呈负相关,APOE e3/e4组中结果不显著。e2/e3组相关情况如下图：  
由于ReHo ratio与记忆提取阶段的d-prime相关性不明显，所以消除掉记忆巩固期间在MTL中由记忆编码引发的激活所带来的潜在的影响，研究使用ANCOVA回归掉该类影响（每个体素的平均β估计）之后，可以得到ReHo ratio与d-prime之间更纯粹的关系。我们发现在 在枕叶中位于(15, -60, 9) 的一个体素的APOE e3/e4组中的ReHo ratio与记忆提取阶段的d-prime之间仍然呈负相关，APOE e2/e3组 ReHo ratio与记忆提取阶段的d-prime之间也呈负相关。结果图示如下： 上述结果可能表明，在相对早期的记忆巩固阶段，编码区在APOE E2/E3组中比在APOE E3/E4Group中参与记忆巩固要多。